Biofyzika

Názov v sekundárnom jazyku práce: Amyloid Fibrils of α-Lactalbumin and Lysozyme: Formation, Characterization, and Stability in Complex Systems

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Amyloidná agregácia predstavuje proces štruktúrnej premeny natívnych proteínov na vysoko usporiadané amyloidné fibrily s typickou sekundárnou štruktúrou krížového β-skladaného listu. Hoci sú amyloidné fibrily tradične spájané s patologickými stavmi označovanými ako amyloidózy, súčasné výskumy poukazujú aj na ich potenciálne využitie v oblasti biotechnologických a potravinárskych aplikácií, najmä ako bioaktívne proteíny s pridanou nutričnou hodnotou. α-laktalbumín (α-LA) a lyzozým patria medzi dobre charakterizované globulárne proteíny s prirodzeným výskytom v potravinových matriciach. α-laktalbumín, proteín prítomný v mlieku cicavcov, a lyzozým, enzým nachádzajúci sa najmä vo vaječnom bielku a sekrétoch cicavcov, predstavujú vhodné modelové systémy na štúdium tvorby amyloidných fibríl a hydrogélov. Lyzozým je známy svojou vysokou stabilitou, antimikrobiálnou aktivitou a schopnosťou tvoriť amyloidné fibrily za definovaných denaturačných podmienok, čo z neho robí atraktívny model pre štúdium vzťahu medzi štruktúrou, stabilitou a funkčnými vlastnosťami amyloidných systémov. Práca sa tiež zameriava na preskúmanie potenciálneho využitia amyloidných fibríl a hydrogélov oboch proteínov v potravinárskom sektore, a to ako výživových doplnkov s pridanou nutričnou hodnotou alebo ako nosičov a stabilizátorov hydrofóbnych bioaktívnych látok. Získané výsledky môžu prispieť k lepšiemu pochopeniu správania sa potravinových amyloidných štruktúr v biologicky relevantných podmienkach a k objasneniu ich potenciálu ako nutričných prípravkov novej generácie.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: Amyloid aggregation is a process by which native proteins undergo a structural transformation into highly ordered amyloid fibrils with a characteristic cross-β sheet secondary structure. Although amyloid fibrils have traditionally been associated with pathological conditions known as amyloidoses, recent research highlights their potential applications in biotechnology and the food industry, particularly as bioactive proteins with added nutritional value. α-Lactalbumin (α-LA) and lysozyme are well-characterized globular proteins that naturally occur in food matrices. α-Lactalbumin, a protein present in mammalian milk, and lysozyme, an enzyme found primarily in egg white and mammalian secretions, represent suitable model systems for studying the formation of amyloid fibrils and hydrogels. Lysozyme is known for its high stability, antimicrobial activity, and ability to form amyloid fibrils under defined denaturing conditions, making it an attractive model for investigating the relationship between structure, stability, and functional properties of amyloid systems. The thesis also explores the potential applications of amyloid fibrils and hydrogels of both proteins in the food sector, either as nutritional supplements with added nutritional value or as carriers and stabilizers of hydrophobic bioactive compounds. The obtained results may contribute to a better understanding of the behavior of food-related amyloid structures under biologically relevant conditions and to elucidating their potential as next-generation nutritional preparations.

Školiteľ: Antošová, Andrea, RNDr. PhD.

Názov v sekundárnom jazyku práce: Biophysical interpretation of metagenomic data of microbial communities

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Metagenomika predstavuje významný nástroj na štúdium mikrobiálnych komunít v biologických systémoch. Napriek širokému využitiu však metagenomické analýzy poskytujú prevažne relatívny opis taxonomického a funkčného zloženia komunít, ktorý neumožňuje priamu interpretáciu ich biologického a biofyzikálneho stavu. Informácie o celkovej mikrobiálnej biomase, rastovej aktivite populácií, metabolických interakciách a stresových podmienkach zostávajú v metagenomických dátach skryté a často vedú k nejednoznačným biologickým záverom. Cieľom tejto teoretickej dizertačnej práce je použiť metódy umelej inteligencie (AI) na biofyzikálnu interpretáciu metagenomických dát mikrobiálnych komunít. Mikrobiálna komunita bude v práci chápaná ako kolektívny biologický systém, ktorého správanie je determinované fyzikálnymi a biologickými faktormi, ako sú celková biomasa, rast buniek, metabolická spolupráca a environmentálny stres. Metagenomické dáta budú interpretované ako neúplné pozorovanie stavového priestoru tohto systému. V práci budú aplikované AI metódy s latentnými premennými, ktoré umožnia z taxonomických a funkčných metagenomických profilov inferovať biologicky interpretovateľné veličiny, ako sú efektívna mikrobiálna biomasa, rastové režimy populácií, miera metabolickej redundancie a stresové stavy komunity. Dôraz bude kladený na biologickú a biofyzikálnu interpretovateľnosť výsledkov a na pochopenie vzťahov medzi biofyzikálnym stavom mikrobiálnej komunity a jej metagenomickým obrazom. Výsledky práce budú využiteľné pri interpretácii dát v mikrobiálnej ekológii, klinickom a preklinickom výskume, ako aj v štúdiách zameraných na vplyv liekov, výživových intervencií a environmentálnych faktorov na mikrobiálne systémy.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: Metagenomics represents an important tool for the study of microbial communities in biological systems. Despite its widespread use, metagenomic analyses predominantly provide a relative description of the taxonomic and functional composition of microbial communities, which does not allow for a direct interpretation of their biological and biophysical state. Information on total microbial biomass, population growth activity, metabolic interactions, and stress conditions remains hidden within metagenomic data and often leads to ambiguous biological conclusions. The aim of this dissertation is to apply artificial intelligence methods for the biophysical interpretation of metagenomic data of microbial communities. In this work, microbial communities will be treated as collective biological systems whose behavior is governed by physical and biological factors such as total biomass, cellular growth, metabolic cooperation, and environmental stress. Metagenomic data will be interpreted as incomplete observations of the state space of these systems. AI methods with latent variables will be employed to infer biologically interpretable quantities from taxonomic and functional metagenomic profiles, including effective microbial biomass, population growth regimes, the degree of metabolic redundancy, and stress-related community states. Emphasis will be placed on the biological and biophysical interpretability of the results and on understanding the relationships between the biophysical state of microbial communities and their metagenomic signatures. The results of this work will be applicable to data interpretation in microbial ecology, clinical and preclinical research, as well as in studies focused on the effects of pharmaceuticals, nutritional interventions, and environmental factors on microbial systems.

Školiteľ: Žoldák, Gabriel, doc. RNDr. DrSc.

Názov v sekundárnom jazyku práce: Biophysical mechanisms of IgG light chain aggregation and the role of serum proteins

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Patologická agregácia imunoglobulínových ľahkých reťazcov IgG predstavuje kľúčový molekulárny proces pri viacerých onkohematologických ochoreniach, najmä pri mnohopočetnom myelóme a AL amyloidóze. Nadprodukcia voľných ľahkých reťazcov vedie k ich akumulácii v extracelulárnom prostredí, kde môžu podliehať konformačným zmenám, agregácii a tvorbe toxických depozitov v tkanivách. Napriek intenzívnemu výskumu zostáva molekulárny mechanizmus agregácie v reálnom sérovom prostredí nedostatočne pochopený. Väčšina existujúcich štúdií sa sústreďuje na izolované proteíny, pričom úloha sérových proteínov ako modulátorov stability a agregácie je často zanedbávaná. Cieľom dizertačnej práce je biofyzikálne charakterizovať mechanizmy agregácie patologických IgG ľahkých reťazcov so zameraním na interakcie so sérovými proteínmi. Agregácia IgG ľahkých reťazcov je interpretovaná ako kineticky riadený proces, determinovaný konformačnou stabilitou, nukleáciou a rastom agregátov v prítomnosti sérových komponentov. V práci budú použité rekombinantné varianty IgG ľahkých reťazcov, in vitro agregačné modely a kvantitatívne biofyzikálne metódy na analýzu kinetiky, stability a štruktúrnych zmien proteínov. Osobitná pozornosť bude venovaná identifikácii sérových proteínov, ktoré agregáciu podporujú alebo inhibujú, a určeniu biologicky relevantnej molekulárnej formy patologického cieľa. Súčasťou práce bude aj testovanie nízkomolekulových kinetických stabilizátorov a šaperónových domén ako nástrojov na potlačenie agregácie. Výsledky dizertačnej práce prispejú k hlbšiemu pochopeniu biofyzikálnych princípov agregácie imunoglobulínových ľahkých reťazcov v extracelulárnom prostredí a poskytnú racionálny základ pre vývoj nových stratégií zameraných na stabilizáciu patologických proteínov v onkohematologických ochoreniach.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: Pathological aggregation of immunoglobulin G (IgG) light chains represents a key molecular process in several oncohematological diseases, particularly multiple myeloma and AL amyloidosis. Overproduction of free light chains leads to their accumulation in the extracellular environment, where they may undergo conformational changes, aggregate, and form toxic deposits in tissues. Despite extensive research efforts, the molecular mechanisms of light chain aggregation under physiologically relevant serum conditions remain insufficiently understood. Most existing studies focus on isolated proteins, while the role of serum proteins as modulators of stability and aggregation is largely neglected. The aim of this dissertation is to biophysically characterize the aggregation mechanisms of pathological IgG light chains with a particular focus on their interactions with serum proteins. The serum environment will be treated as a complex physicochemical system in which protein–protein interactions, ligand binding, and kinetic stability critically determine aggregation pathways. Aggregation of IgG light chains will be interpreted as a kinetically controlled process governed by conformational stability, nucleation, and aggregate growth in the presence of serum components. The work will employ recombinant IgG light chain variants, in vitro aggregation models, and quantitative biophysical methods to analyze aggregation kinetics, protein stability, and structural changes. Special emphasis will be placed on identifying serum proteins that promote or inhibit aggregation and on defining the biologically relevant molecular form of the pathological target. The dissertation will also explore low-molecular-weight kinetic stabilizers and selected chaperone domains as potential tools for suppressing aggregation. The results of this work will advance the understanding of the biophysical principles underlying immunoglobulin light chain aggregation in extracellular environments and provide a rational framework for the development of novel stabilization-based strategies in the treatment of oncohematological diseases.

Školiteľ: Žoldák, Gabriel, doc. RNDr. DrSc.

Názov v sekundárnom jazyku práce: Chemical and Morphological Mapping of Living Cells Using Raman Microscopy and Surface-Enhanced Raman Spectroscopy

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Ramanova spektroskopia (RS) je nedeštruktívna vibračná analytická metóda poskytujúca špecifickú štrukturálnu informáciu na úrovni molekúl. Ramanove spektrum predstavuje jedinečný „odtlačok prsta“ analyzovanej zlúčeniny. Vďaka minimálnym nárokom na prípravu vzorky, možnosti meraní vo vodných roztokoch a absencii potreby externého značenia nachádza RS významné uplatnenie v biomedicínskych aplikáciách. Navyše, kombinácia RS s optickou mikroskopiou, známa ako Ramanova mikroskopia, umožňuje chemické mapovanie buniek, tkanív a subbunkových štruktúr s priestorovým rozlíšením približne 1 μm, a to aj v živých systémoch a pri fyziologických podmienkach. Praktické využitie RS je však obmedzené jej nízkou citlivosťou a interferenciou zvyčajne silného fluorescenčného pozadia. Tieto limity je možné prekonať použitím povrchovo-zosilnenej Ramanovej spektroskopie (SERS), ktorá vďaka prítomnosti kovových nanočastíc umožňuje výrazné zosilnenie Ramanovho signálu, potlačenie fluorescencie a následne aj detekciu nízkych koncentrácií molekúl. Dôležitú úlohu v tomto kontexte zohrávajú aj špecifické Ramanove značky a SERS-aktívne nanoštruktúry, ktoré výrazne rozširujú možnosti cieleného a spektrálne bohatého Ramanovho zobrazovania. Cieľom dizertačnej práce je použitie a rozvoj Ramanovej mikroskopie a SERS na štúdium chemických, štrukturálnych a morfologických zmien živých buniek vyvolaných rôznymi faktormi, ako sú expozícia nanočasticiam, interakcia s bioaktívnymi molekulami (napr. liečivami), aplikácia žiarenia alebo fotodynamická terapia. Osobitný dôraz bude kladený na výber, štúdium a optimalizáciu Ramanových značiek, ako aj na návrh nových značiek vhodných pre cielené a spektrálne bohaté Ramanovo zobrazovanie biologických systémov. Súčasťou práce bude aj chemometrická analýza hyperspektrálnych Ramanových dát zameraná na identifikáciu spektrálnych markerov a kvantitatívnych korelácií medzi chemickými zmenami a biologickými procesmi. Výsledky práce majú prispieť k rozvoju Ramanovej a SERS mikroskopie ako neinvazívnych a molekulovo špecifických nástrojov pre biofyzikálnu analýzu buniek.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: Raman spectroscopy (RS) is a non-destructive vibrational analytical technique that provides specific structural information at the molecular level. A Raman spectrum represents a unique “fingerprint” of the analyzed compound. Owing to minimal sample preparation requirements, the ability to perform measurements in aqueous solutions, and the absence of a need for external labelling, RS has found significant applications in biomedicine. Moreover, the combination of RS with optical microscopy, known as Raman microscopy, enables chemical mapping of cells, tissues, and subcellular structures with a spatial resolution of approximately 1 μm, including measurements in living systems under physiological conditions. However, the practical use of RS is limited by its low sensitivity and interference from typically strong fluorescence background signals. These limitations can be overcome by surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), which, due to the presence of metal nanoparticles, enables a substantial enhancement of the Raman signal, fluorescence suppression, and consequently the detection of low molecular concentrations. In this context, specific Raman tags and SERS-active nanostructures play also an important role, as they significantly expand the possibilities for targeted and spectrally rich Raman imaging. The aim of the PhD thesis is to apply and further develop Raman microscopy and SERS for the study of chemical, structural, and morphological changes in living cells induced by various factors, such as exposure to nanoparticles, interactions with bioactive molecules (e.g., drugs), radiation exposure, or photodynamic therapy. Particular emphasis will be placed on the selection, investigation, and optimization of Raman tags, as well as on the design of new tags suitable for targeted and spectrally rich Raman imaging of biological systems. The thesis will also include chemometric analysis of hyperspectral Raman data aimed at identifying relevant spectral markers and quantitative correlations between chemical changes and biological processes. The results are expected to contribute to the development of Raman and SERS microscopy as non-invasive and molecularly specific tools for biophysical analysis of cells.

Školiteľ: Jurašeková, Zuzana, RNDr. PhD.

Názov v sekundárnom jazyku práce: Generative Modeling of Nanobody Conformational Ensembles

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Jednodoménové protilátky (nanotelá alebo VHH) sa stali kľúčovými terapeutickými modalitami vďaka svojim predĺženým slučkám v oblasti určujúcej komplementaritu 3 (CDR3). Tieto slučky majú schopnosť preniknúť do kryptických epitopov, ktoré sú pre konvenčné imunoglobulíny nedostupné. Súčasná paradigma výpočtového dizajnu proteínov sa však silne spolieha na statické štrukturálne predikcie odvodené z modelov ako AlphaFold a ProteinMPNN. Tieto modely primárne generujú súradnice tuhých verzií štruktúrnych dát na základe kryštalografických meraní, čím zanedbávajú termodynamickú flexibilitu a entropické príspevky, ktoré riadia vysokoafinitnú väzbu a špecifickosť. Toto „statické skreslenie“ limituje vývoj viazačov pre vnútorne neusporiadané oblasti alebo ciele vyžadujúce mechanizmus indukovaného prispôsobenia (induced-fit), ako sú receptory spriahnuté s G-proteínmi (GPCR). Táto dizertačná práca navrhuje nový rámec generatívnej umelej inteligencie navrhnutý na predikciu a inžinierstvo konformačných súborov (ensembles) nanotelies namiesto jednotlivých statických štruktúr. Premostením priepasti medzi vysoko-priepustnými simuláciami molekulárnej dynamiky (MD) a geometrickým hlbokým učením (geometric deep learning) si tento výskum kladie za cieľ naučiť sa latentnú varietu fluktuácií CDR slučiek. Metodológia zahŕňa konštrukciu komplexného „dynamického atlasu“ pohybov VHH, trénovanie SE(3)-ekvivariantnej grafovej neurónovej siete na predikciu distribučnej štrukturálnej variancie a vývoj difúzneho generatívneho modelu podmieneného špecifickými profilmi pohybu.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: Single-domain antibodies (nanobodies or VHHs) have emerged as powerful therapeutic modalities due to their extended Complementarity Determining Region 3 (CDR3) loops, which can penetrate cryptic epitopes inaccessible to conventional immunoglobulins. However, the current paradigm of computational protein design relies heavily on static structural predictions derived from models like AlphaFold and ProteinMPNN. These models predominantly output rigid-body coordinates based on crystallographic data, thereby neglecting the thermodynamic flexibility and entropic contributions that govern high-affinity binding and specificity. This "static bias" limits the development of binders for intrinsically disordered regions or targets requiring induced-fit mechanisms, such as G-protein-coupled receptors (GPCRs). This thesis proposes a novel generative artificial intelligence framework designed to predict and engineer nanobody conformational ensembles rather than single static structures. By bridging the gap between high-throughput Molecular Dynamics (MD) simulations and geometric deep learning, this research aims to learn the latent manifold of CDR loop fluctuations. The methodology involves the construction of a comprehensive "dynamic atlas" of VHH motions, training an SE(3)-equivariant graph neural network to predict distributional structural variance, and developing a diffusion-based generative model conditioned on specific motion profiles.

Školiteľ: Sedlák, Erik, prof. RNDr. DrSc.

Názov v sekundárnom jazyku práce: Molecular Mechanisms of Amyloid Protein Aggregation and Its Inhibition

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Amyloidné štruktúry sú spájané s neurodegeneratívnymi ochoreniami (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba), ale čoraz častejšie sa uznáva, že amyloidové štruktúry môžu vytvárať všetky proteíny, vrátane proteínov nachádzajúcich sa v potravinách (laktalbumín, laktoglobulín). Dôležité je identifikovať vhodné podmienky pre tvorbu amyloidných agregátov a zároveň možnosť predchádzať alebo zamedziť tvorbe ochorení, ktoré vzniknú poškodením proteínov.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: Amyloid structures have been associated with neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson´s disease), but it is increasingly accepted that all proteins can form amyloid structures, including food proteins (lactalbumin, lactoglobulin). It is important to identify favorable conditions for the formation of amyloid aggregates and, at the same time, the possibility of preventing or circumventing undesirable health effects by altering the protein.

Školiteľ: Gažová, Zuzana, doc. RNDr. DrSc.

Názov v sekundárnom jazyku práce: Protein-Based and Hybrid Biomaterials for Biomedical Applications

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Proteíny s výnimočnými štrukturálnymi a funkčnými vlastnosťami, ako sú biokompatibilita, biologická odbúrateľnosť, dostupnosť a nízka schopnosť vyvolávať imunitné alebo zápalové reakcie tkanív, predstavujú perspektívne stavebné prvky biomateriálov, vrátane hydrogélov. Tieto materiály sa vyznačujú možnosťou presnej kontroly mechanickej pevnosti, chemickej stability a bioaktivity, vďaka čomu nachádzajú uplatnenie v tkanivovom inžinierstve, cielenom podávaní liekov a biosenzorike.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: Protein-based hydrogels are a versatile class of biomaterials, valued for their biocompatibility, biodegradability, and ability to self-assemble into well-defined nanostructures. Beyond purely protein systems, hybrid hydrogels incorporating additional molecules or nanoparticles offer expanded functionality and tunable properties. These materials can be precisely engineered in terms of mechanical strength, chemical stability, and bioactivity, making them suitable for applications in tissue engineering, drug delivery, and biosensing.

Školiteľ: Šipošová, Katarína, Ing. RNDr. PhD.

Názov v sekundárnom jazyku práce: Directed Evolution of Haloalkane Dehalogenases.

Anotácia v hlavnom jazyku práce: Dizertačná práca je zameraná na inžinierstvo haloalkánových dehalogenáz (HLD), enzýmov schopných degradovať halogénované organické zlúčeniny predstavujúce významnú environmentálnu záťaž. Hlavným cieľom je pripraviť nové varianty enzýmu s vyššou tepelnou stabilitou a katalytickou aktivitou prostredníctvom riadenej evolúcie hyperstabilného variantu DhaA115. Výskum využije kombináciu ribozómového displaya a technológie HaloTag, ktorá umožňuje efektívny výber funkčných enzýmov a prekonáva obmedzenia reverzibilných interakcií enzým-substrát. Vybrané varianty budú identifikované pomocou vysokokapacitného skríningu, následne produkované rekombinantne v E. coli a podrobené komplexnej biofyzikálnej a štruktúrnej charakterizácii vrátane analýzy tepelnej stability, kinetických parametrov a röntgenovej kryštalografie. Očakávaným prínosom práce je hlbšie pochopenie vzťahov medzi štruktúrou a funkciou HLD a vytvorenie prenositeľnej platformy pre evolúciu dehalogenáz. Získané poznatky môžu rozšíriť spektrum enzýmov využiteľných v biokatalýze a environmentálnej bioremediácii, čím prispejú k rozvoju ekologicky udržateľných biotechnológií.

Anotácia v sekundárnom jazyku práce: This doctoral thesis focuses on the engineering of haloalkane dehalogenases (HLDs), enzymes capable of degrading halogenated organic pollutants that pose a significant environmental risk. The primary objective is to develop novel enzyme variants with improved thermal stability and catalytic activity through the directed evolution of the hyperstable DhaA115 variant. The research will employ a combination of ribosome display and HaloTag technology, enabling the efficient selection of catalytically competent enzymes while overcoming the limitations associated with reversible enzyme–substrate interactions. Selected variants will be identified via high-throughput screening, recombinantly produced in E. coli, and subjected to comprehensive biophysical and structural characterization, including thermal stability assessment, kinetic analysis, and X-ray crystallography. The expected outcome is a deeper understanding of structure–function relationships in HLDs and the establishment of a transferable platform for dehalogenase evolution. The results may expand the portfolio of enzymes applicable in biocatalysis and environmental bioremediation, supporting the development of sustainable biotechnological solutions.

Školiteľ: Sedlák, Erik, prof. RNDr. DrSc.